Inmunolocalización de ADN exógeno en espermatozoides porcinos sometidos a diferentes tratamientos

Abstract

La transgénesis mediada por espermatozoides (SMGT) es una técnica basada en la habilidad intrínseca de las células espermáticas de unir ADN exógeno y poder ser usada para la producción de embriones y animales transgénicos. El objetivo de este estudio fue localizar mediante inmunocitoquímica, la unión del transgén en los espermatozoides porcinos sometidos a diferentes tratamientos (frescos-F, congelados/descongelados-CD y congelación rápida–CR) de tal modo que presentaban diferentes grados de alteración de las membranas. Las muestras de semen fueron incubadas con el plásmido (EGFP 5,4 kb) marcado con digoxigenina (DIG) en medio SFM (1x108 espermatozoides/ mL + 5µg ADN/mL). Se utilizaron anticuerpos anti-DIG marcados con fluoresceína (FITC) para la localización del ADN mediante el microscopio de fluorescencia. Los espermatozoides fueron clasificados en 4 categorías según su localización: 1) región acrosomal, 2) región post-acrosomal, 3) en ambas regiones (acrosomal y post-acrosomal), 4) sin ADN unido. Mediante el microscopio de fluorescencia se observaron diferencias en el porcentaje y el patrón de unión en los espermatozoides sometidos a los diferentes tratamientos. Los espermatozoides sometidos a un proceso de CR presentaron un mayor porcentaje de unión que el semen F (CR: 88,29 ± 2,38% vs. F: 63,46 ± 5,90%, P<0,01), mientras que el grupo de espermatozoides CD presentó valores intermedios (74,00 ± 3,05%). Así, en los espermatozoides F el ADN se une principalmente en la región acrosomal (F: 51,09 ± 7,70%, FT: 17,77 ± 4,49%, CR: 7,76 ± 1,58%, P<0,01). Por otro lado, cuando los espermatozoides CD y CR fueron evaluados, la unión del ADN se localizaba en ambas regiones (F: 40,04 ± 5,88%, CD: 54,82 ± 2,55%, CR: 78,09 ± 1,75%, P<0,01). En conclusión, existe un patrón de distribución diferente del ADN exógeno dependiendo del grado de alteración de las membranas espermáticas.