Construcción de un Vector de Virus de Planta Portando una Secuencia Mutagenizada del GEN NEF Del HIV-1
Fecha
2017-01Autor
Palabras Clave
Infectividad, Mutagénesis sitio-dirigida, Quimera viral, Transcripción in vitro, Virus de inmunodeficiencia humanaInfectivity, Site-directed mutagenesis, Viral chimera, In vitro transcription, Human inmunodeficiency virus
Metadatos
Mostrar el registro completo del ítemResumen
Los vectores de virus de plantas representan una alternativa excelente como sistema
de expresión de proteínas heterólogas, especialmente de biofármacos y vacunas
multicomponentes. Diferentes antígenos del HIV-1 han sido expresados exitosamente en
plantas a través de sistemas de transformación estable o expresión transitoria. Dentro del
grupo de proteínas que componen el virión del HIV, Nef es considerada un blanco promisorio
para la formulación de vacunas debido al papel que desempeña durante los primeros pasos de
la infección viral. En el presente trabajo se reportan los resultados de la construcción de una
quimera viral portando una secuencia modificada del gen nef del HIV-1. Se introdujeron dos
sustituciones puntuales en los sitios reconocidos por las enzimas de restricción XhoI y KpnI
utilizando la técnica de amplificación por PCR. Con este propósito se emplearon dos cebadores
mutagénicos y dos silvestres en tres rondas de amplificación por PCR para cada sustitución.
Los amplicones portadores de la doble mutación fueron ligados al vector de expresión viral
pTMV30B-GFPC3, y se multiplicaron por transformación en células de E. coli XL1-blue; los cuales
fueron posteriormente purificados y analizados por digestión y secuenciación. Los productos
de la transcripción in vitro de esta quimera se inocularon en plantas de Nicotiana benthamiana,
y la infectividad de los transcriptos se validó por sintomatología y RT-PCR. Los resultados
demostraron que la quimera viral construida produjo transcriptos infectivos capaces de inducir
síntomas característicos en las plantas inoculadas; lo cual abre la posibilidad para desarrollar
una vacuna anti-HIV producida en plantas.
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Otros Títulos | Construction of a Vector of Plant Virus Carrying a Mutagenized Sequence of HIV-1 NEF GENE |
Correo Electrónico | pittieria@ula.ve |
ISSN | 0554-2111 |
Resumen en otro Idioma | The vectors of plant virus represent an excellent alternative as expression system of heterologous proteins especially of biopharmaceuticals and multicomponent vaccines. Different HIV-1 antigens have succesfully been expressed in plants through stable transformation systems or transitory expression. Among the proteins group that compound the HIV virion, Nef is cosidered a promissing target to vaccine formulation due to the role it develops during the first viral infection steps. In the present study, the results of the construction of a viral chimera carrying a modified sequence of HIV-1 nef gene are reported. Two puntual substitutions were introduced in the sites recognized by the XhoI and KpnI restriction enzymes using the amplification technique by PCR. With this purpose, two mutagenic and two wild primers were used in three amplification rounds by PCR for each substitution. The amplicons carrying the double mutation were linked to the pTMV30B-GFPC3 viral expression vector and were multiplied by transformation in E. coli XL1-blue cells, which were purified and analyzed later by digestion and sequencing. The in vitro transcription products of this chimera were inoculated in Nicotiana benthamiana plants, and the infectivity of the transcripts was validated by sintomatology and RT-PCR. The results showed that the constructed viral chimera produced infectious transcripts capable to induce characteristic symptoms in inoculated plants which opens the possibility to develop an anti-HIV vaccine produced in plants. |
Colación | 40-69 |
Periodicidad | Anual |
País | Venezuela |
Publicación Electrónica | Pittieria |
Sección | Pittieria: Artículos |