www.saber.ula.ve/avancesenquimica 3 Avances en Química, 5(1), 3-14 (2010) Artículo científico Factores que influyen en el comportamiento electroquímico de sustancias de interés médico y farmacológico en electrodos modificados Sabino Menolasina*, Anunziata De Santis, Flor Díaz, Angelys Sánchez, Anfrelis Aguilar, Olga Contreras Universidad de Los Andes, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Departamento de Análisis y Control, Laboratorio de Análisis Instrumental, Mérida-Venezuela (*) sabino@ula.ve Recibido: 06/08/2009 Revisado: 19/01/2010 Aceptado: 05/04/2010 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Resumen: Se prepararon diferentes sensores y biosensores electroquímicos con electrodos de carbón vítreo, oro y platino para estudiar el comportamiento electroquímico de sustancias inorgánicas (iones Cu(II) y iones Zn(II)) y orgánicas (Dopamina (DA) y glucosa). El comportamiento electroquímico de estas sustancias se ve influenciado por diversos factores, tales como: formación de compuestos intermetálicos, efectos difusionales o efectos electrostáticos, dependiendo del tipo de modificación que se haga sobre la superficie electródica del sensor o biosensor electroquímico. Palabras clave: Dopamina; glucosa; tirosinasa; glucosa oxidasa; laponita; microgeles; biosensor enzimático. Abstract Electrochemical sensors and biosensors with glassy carbon, gold and platinum were prepared to study the electrochemical behavior of inorganic (Cu(II) and Zn(II) ions) and organic (dopamine (DA) and glucose) compounds. The electrochemical behavior of these substances is influenced by various factors, including: intermetallic compounds formation, diffusional effects or electrostatic effects, depending on the type of change that takes place on the electrode surface. Keywords: dopamine; glucose; tyrosinase; glucose oxidase; laponite; microgel; enzyme biosensor. Introducción El uso de electrodos modificados físicamente o química- Las reacciones que se llevan a cabo sobre una superficie mente al azar o por conveniencia puede disminuir la electródica son procesos heterogéneos cuya cinética velocidad de transferencia de carga produciendo cambios depende de la transferencia de masa, la velocidad con que en la repuesta electroquímica. Estos cambios pueden ser se realiza la transferencia de carga, así como de la registrados, por ejemplo utilizando técnicas voltampero- velocidad con que se llevan a cabo las reacciones químicas métricas, tales como, Voltamperometría Cíclica (VC), acopladas con transferencia de carga en la interfase Voltamperometría de pulso diferencial (VPD) y electrodo-solución1. El éxito en el estudio del comporta- Voltamperometría de Onda Cuadrada (VOC). El uso de miento electroquímico de una sustancia electroactiva VC ha permitido caracterizar el comportamiento electro- radica en utilizar el dispositivo electroquímico adecuado químico de muchas sustancias electroactivas ya que asegurándose de que el mismo se encuentre exento de permite conocer sobre la reversibilidad del proceso impurezas que puedan afectar dicho comportamiento y que electroquímico y sobre la estabilidad del analito en los las modificaciones que se hagan sobre su superficie diferentes estados de oxidación en los cuales se puede electrodica no afecten considerablemente la respuesta presentar en el proceso electroquímico, así como los electroquímica del analito de interés. Por ejemplo, la potenciales a los cuales se reduce o se oxida las especies respuesta de un biosensor amperométrico puede ser electroactivas que resultan de la oxidación o reducción del afectada por efectos microambientales de difusión debido analito de interés electroquímico, permitiendo además a la naturaleza de la matriz sólida que se emplee para conocer sobre el estado de limpieza de la superficie soportar el enzima y el transporte de masa que se electródica, así como, sobre los procesos de adsorción que desarrolla en las cercanías dicho sensor. se pueden originar en dicha superficie 1. 4 S Menolasina, A De Santis, F Díaz, A Sánchez, A Aguilar, O Contreras /Avances en Química 5(1), 3-14 (2010) El Zinc y el Cobre son micros nutrientes esenciales, debido En el presente trabajo se estudió el comportamiento a su química particular; cumplen numerosas funciones electroquímico de ciertas sustancias de interés médico y estructurales y bioquímicas regulando diferentes sistemas farmacológico tales como, iones Zn(II), Cu(II), DA y biológicos. Su deficiencia genera desde una gran variedad glucosa con sensores y biosensores electroquímicos de manifestaciones clínicas inespecíficas leves hasta una construidos a través de la modificación de electrodos de disfunción generalizada en los casos más graves, dando carbón vítreo, de oro y platino con sustancias inorgánicas y lugar a problemas de salud a nivel mundial que afectan orgánicas. tanto a países desarrollados como a aquellos en vías de desarrollo2. Parte experimental La DA es una de esas especies electroactivas de interés Reactivos médico y farmacológico. La enfermedad de Parkinson es La tirosinasa (TIROS) con una actividad de 1530 UI/mg producto de un desorden degenerativo crónico y de sólido, la glucosa oxidasa (GO) con una actividad de lentamente progresivo a nivel cerebral, cuyos síntomas 5600UI/mg de sólido y el NN’-metilen-bis-acrilamida incluyen postura rígida, temblor de reposo, lentitud del fueron suministrados por Sigma-Aldrich. La dopamina movimiento voluntario; en esta enfermedad la principal (DA) y el glutaraldehído (GA), disolución acuosa 25%, el anomalía bioquímica es la deficiencia de DA en el cuerpo 2 persulfato de amonio (PSA), el Span 80, NNN’N’-tetra-estriado (núcleo caudado y putamen) . La DA pertenece al metil-etilen-diamina (TEMED), el dodecano y el ácido grupo de neurotransmisores llamados catecolaminas. Este 5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB) fueron neurotransmisor se oxida fácilmente y es por esta razón suministrados por Fluka. La laponita (LAP) fue que han sido desarrollados varios métodos electroquímicos suministrada por Rockwood Specialities Inc (Princeton, basados en la oxidación de la misma, a fin de monitorear 3-5 NJ). Las sales de nitrato de Cu(II), Zn (II) y Hg(II) su concentración . Sin embargo la determinación utilizadas fueron de grado analítico (alta pureza) electroquímica de DA es complicada debido a la provenientes de la Merck. El ácido 2-N-bencil-1- interferencia de varias sustancias presentes en el medio ciclopenten-di-tiocarboxílico (tiol I) y el ácido 2-N-metil- donde esta se oxida. El ácido ascórbico (AA) es una de 1-ciclopenten-di-tiocarboxílico (tiol II) fueron sintetizados esas sustancias que se encuentran presente en grandes y suministrados por el laboratorio de Organometálicos de concentraciones y se oxida a potenciales cercanos al 3,4 la Escuela de Química de la Facultad de Ciencias, propio potencial de oxidación de la dopamina . Para Universidad de Los Andes, Venezuela. incrementar la selectividad en la detección de esta sustancia se han desarrollado muchos métodos La membrana de diálisis (MD) con un corte de peso relacionados con el pretratamiento y modificación de la molecular (MWCO) comprendido entre 12.000 y 14.000 superficie del electrodo utilizado como sensor o daltons por Spectrum Medical Industries. El agua utilizada biosensor6-13. Por ejemplo se han utilizado electrodos de fue de calidad Milli Q 18 MΩ (Millipore, Milford, MA, oro modificados con tioles11, electrodos de carbón vítreo USA). modificados con arcillas12 y electrodos de pasta de carbón Todos los reactivos fueron utilizados sin ningún modificados con micelas de dodecil sulfato sódico13. tratamiento adicional de purificación. Dentro de los electrodos enzimáticos el mayor número de Soluciones stock de iones Cu(II), Hg(II) y Zn (II) fueron biosensores desarrollados corresponde sin lugar a dudas a preparadas y estabilizadas con pequeñas cantidades de los que se basan en la inmovilización de glucosa oxidasa, HNO3 en agua desionizada de 18MΩ.cm. Soluciones de dada la alta estabilidad de esta enzima y la gran utilidad de más baja concentración de estos iones fueron preparadas estos sensores en el mercado de los análisis de glucosa en por dilución de las soluciones stock con agua desionizada sangre14-19. La glucosa oxidasa no transfiere electrones de 18MΩ.cm. directamente a electrodos convencionales, debido a que una gruesa capa proteica rodea su centro FAD, hecho Aparatos bastante común entre las flavoproteinas. Dicha capa Los voltamperogramas se realizaron en un potenciostato introduce una separación espacial en la pareja galvanostato Autolab PGSTAT12 y una celda de vidrio de dador/aceptor de electrones y, por lo tanto, existe una un compartimiento y tres electrodos. Electrodos de barrera intrínseca a la transferencia de electrones. Por ello, Ag/AgCl (sat) y de calomel saturado (ECS) fueron la minimización de esa distancia es crucial para asegurar utilizados como electrodos de referencias y un alambre de un funcionamiento óptimo de esta enzima cuando se platino como electrodo secundario. Como electrodos de trabaja con biosensores amperométricos18. trabajo se utilizaron, electrodos de disco de carbón vítreo (CV), (d = 3mm); platino Pt (d = 3mm) y de oro (Au) (d = S Menolasina, A De Santis, F Díaz, A Sánchez, A Aguilar, O Contreras /Avances en Química 5(1), 3-14 (2010) 5 2mm) sin modificación y modificados con diferentes se realizó in situ en la solución electrolítica que sustancias orgánicas e inorgánicas. contiene los iones metálicos de interés aplicando un Tratamiento de la celda electroquímica y del material de potencial de preconcentración de -1,20 V durante vidrio utilizado 300 s. Bajo estas condiciones experimentales se forma una amalgama del mercurio con el metal que Todo el material de vidrio utilizado y la celda se quiere determinar la cual es homogénea, estable y electroquímica fueron lavados inicialmente con detergente, reproducible. posteriormente con una mezcla de H2SO4:H2O2 (1:1) durante 10 min. y finalmente con abundante agua B) Sensor electroquímico DTNB/Au. El electrodo de desionizada. Este procedimiento se repitió siempre que se oro se sumerge en una solución saturada de dicho sospechara de una posible contaminación del material de ditiol en cloroformo, durante 15 min, siguiendo el 11 vidrio o de la celda. procedimiento descrito por Menolasina et.al. . Luego el electrodo es lavado con cloroformo para Síntesis de microgeles de poliacrilamida remover la cantidad del tiol que se ha adsorbido La inmovilización de glucosa oxidasa en el interior de los físicamente en las paredes cercanas al disco de oro microgeles de poliacrilamida se realizó mediante el C) Sensores electroquímico tiol I/Au. El electrodo de método de polimerización desde emulsión concentrada de oro se sumerge en una solución saturada de dicho tiol fase interna acuosa (W/O)20, siendo la fracción máxima de en cloroformo, durante 60 min, siguiendo el volumen Φ = 0,86. Para asegurarse de que la emulsión sea procedimiento descrito por Menolasina et.al.11. de fase interna acuosa (W/O) se utilizó el tensoactivo Span Luego el electrodo es lavado con cloroformo para 80 (monooleato de sorbitol), con un coeficiente hidrofilia- remover la cantidad del tiol que se ha adsorbido lipofilia (HLB) de 4,3. La fase oleosa la conformo el Span físicamente en las paredes cercanas al disco de oro. 80, junto con el dodecano y la fase acuosa la conformo una cierta cantidad de disolución reguladora de fosfato sódico D) Sensores electroquímico tiol II/Au. El electrodo de 0,1 M, pH 6,0, el monómero (acrilamida), el agente oro se sumerge en una solución saturada de dicho tiol reticulante (NN’-metilen-bis-acrilamida) y el agente en cloroformo, durante 10 min, siguiendo el iniciador PSA. procedimiento descrito por Menolasina et.al. 21. Luego el electrodo es lavado con cloroformo para Tratamiento de los electrodos de trabajo sin modificar remover la cantidad del tiol que se ha adsorbido Los electrodos de carbón vítreo, oro y platino utilizados físicamente en las paredes cercanas al disco de oro. como electrodos de trabajo se sometieron en primer lugar a E) Sensores electroquímico LAP/CV. Se prepara una un tratamiento químico por inmersión de estos en una suspensión de LAP añadiendo 2 mg de LAP en 1 mL mezcla de H2SO4:H2O2 (1:1) durante 10 segundos y luego de agua desionizada y se depositan aproximadamente fueron pulidos con alúmina 0,05 µm usando agua 25 µL de dicha suspensión sobre la superficie del desionizada como lubricante. Posterior a dicha limpieza electrodo de CV. Se le aplica aire caliente hasta la mecánica, estos electrodos fueron tratados electro total evaporación del líquido con la finalidad de químicamente; el electrodo de carbón vítreo fue ciclado formar una fina película de LAP adsorbida sobre la entre -0,20 V hasta 0,60 V vs. Ag/AgCl (sat) en una superficie electródica. solución 0,1 M fosfato buffer pH = 6, durante un determinado número de barridos por VC a 200 mV s-1. F) Biosensor electroquímico GA/LAP-TIROS/CV. Se Mientras que los electrodos de platino y oro fueron prepara una suspensión de 2 mg de LAP en 1 mL de ciclados entre –0,20 V hasta 1,50V vs. Ag/Ag Cl (sat) en agua desionizada y una disolución de 2 mg de una solución 0,1M HClO4 también durante un determinado TIROS en 1 mL de solución buffer fosfato 0,1 M, pH número de barridos por VC a 200 mV s–1. = 6, siguiendo el procedimiento descrito por Mousty et. al. 22. Se procede luego a mezclar 15 µL de cada Electrodos de trabajo modificados una de las suspensiones con la finalidad de que la Una vez que los electrodos de trabajo fueron tratados relación sea 1:1. La cantidad resultante de la mezcla siguiendo los pasos descritos anteriormente se procedió a se deposita sobre la superficie del electrodo de CV y realizar las distintas modificaciones de sus superficies con se deja secar a temperatura ambiente hasta que se la finalidad de desarrollar los sensores y biosensores forme una película de la mezcla sobre la superficie electroquímicos utilizados en el presente trabajo. del electrodo. Luego se coloca dicho electrodo modificado con LAP/TIROS en un recipiente cerrado A) Sensor electroquímico Hg/CV. La electrodeposición saturado con GA gaseoso durante 30 min. Este de la película de mercurio sobre la superficie de CV procedimiento se realiza para que se establezcan 6 S Menolasina, A De Santis, F Díaz, A Sánchez, A Aguilar, O Contreras /Avances en Química 5(1), 3-14 (2010) enlaces intermoleculares covalentemente con grupos barrido de potencial ya sea por oxidación o reducción de del soporte y del propio enzima, o intramoleculares dicha sustancia u otro compuesto en donde la sustancia se entre dos grupos de la misma molécula de enzima, ha preconcentrado formando un complejo. El grado de reteniendo de esa forma la enzima en dicha matriz. sensibilidad que se obtiene depende de la señal de G) Biosensor electroquímico de microgeles de excitación que se le aplique al electrodo de trabajo y del MD/PAA-GO/Pt. Sobre la superficie del electrodo de tipo de electrodo modificado que se utilice para tal fin. platino se atrapa físicamente una cantidad Comportamiento electroquímico del zinc en un electrodo determinada de microgeles de policrilamida que de Hg/CV). En la figura 1 se muestra la familia de contienen la enzima glucosa oxidasa a través de una voltamperogramas obtenidos por VPD al aplicar un membrana de diálisis la cual es sujeta al electrodo barrido de potencial en la dirección anódica, una vez que con hilos, asegurándose de que no quede aire se aplicado un potencial de preconcentración de -1,2 V atrapado entre el electrodo y la membrana, siguiendo durante un tiempo determinado a un electrodo de CV en el procedimiento descrito por Hervás Pérez14. soluciones preparadas al adicionar sucesivamente una solución patrón de Zn(II) a una muestra de líquido seminal Resultados y discusión previamente pretratada en medio ácido, observándose que Efectos de preconcentración el pico de corriente de redisolución anódica a -1,17 V vs. ECS correspondiente a la oxidación de Zn(0) a Zn(II) se Entre los factores que pueden influir en la detección y incrementa, siendo proporcional al aumento en cuantificación de sustancia sobre superficies electródicas concentración de Zn(II) en la celda electroquímica. Este modificadas esta el modo en que se pre-concentra el comportamiento muestra que el electrodo de CV una vez analito. Para determinar concentraciones muy bajas de modificado con una delgada capa de mercurio bajo ciertas metales, tales como Cu(II) y Zn(II) que son micro condiciones experimentales es bastante sensible a cambios nutrientes esenciales se suele emplear técnicas de de concentración en iones Zn(II). preconcentración de estas sustancias sobre la superficie de electrodos modificados con películas de metales o La estabilidad y definición de este pico de corriente de compuestos orgánicos. Esta técnica se basa prácticamente redisolución anódica del Zn a Zn(II), depende del pH en la en dos etapas, una de preconcentración de la sustancia que celda electroquímica, así como del potencial, tiempo de se desea analizar sobre la superficie del electrodo de electrodeposición aplicado al electrodo de trabajo y de la trabajo y otra de redisolución al aplicar un determinado Figura 1: Voltamperogramas obtenidos por VPD de la oxidación de Zn(0) a Zn(II) en una muestra de líquido seminal a la cual se añadieron cantidades determinadas de una solución patrón de Zn(II), utilizando un electrodo de carbón vítreo modificado electroquímicamente con una película de mercurio. S Menolasina, A De Santis, F Díaz, A Sánchez, A Aguilar, O Contreras /Avances en Química 5(1), 3-14 (2010) 7 presencia o no de otros iones metálicos en la solución. La hasta +1,25 V se observan los picos A y B. El pico A a - presencia de otros iones metálicos puede originar la 1,10 V corresponde a la oxidación del Zn metálico formación de compuestos intermetálicos con el analito en depositado en la amalgama de mercurio y el pico B a la la película de mercurio. Este es un factor que puede afectar oxidación del Hg metálico de la película depositada sobre el comportamiento electroquímico del analito de interés. la superficie electródica. La figura 2A muestra el comportamiento del electrodo de Cuando en el medio electrolito existe la presencia de iones CV en una solución que contiene solamente iones Hg(II) y Cu(II) (figura 2B), no se observa el pico de oxidación de iones Zn(II) en donde el barrido de potencial se ha iniciado Zn metálico que se observa en la figura 2A y se observa en la dirección catódica desde +1,25 V hasta -1,20 V. además que cuando el barrido de potencial se invierte en la Durante el barrido catódico entre 0,25 V hasta -0,90 V se dirección anódica desde -1,20 V se produce un observan varios picos, algunos de los cuales se solapan entrecruzamiento con la respuesta obtenida durante el entre sí (B*, C*, D*). Estos picos son atribuidos al proceso barrido en la dirección catódica en el voltamperograma, de reducción de los iones Zn(II) y Hg(II) sobre la este entrecruzamiento es atribuído a la respuesta de una superficie de CV. A potenciales más negativos de -1,20 V superficie electródica distinta a la que se tiene cuando el se observa un incremento de la corriente el cual es barrido se realiza en la dirección catódica. atribuido a la formación de hidrogeno. Al revertirse el barrido de potencial en la dirección anódica desde -1,20 V A B Figura 2: Voltamperogramas cíclicos obtenidos con un electrodo de carbón vítreo en: A) una solución 0,1 M KNO3 (1=solución blanco) y en una solución 0,1 M KNO + 5x103 M Hg2+ + 1x10-3 M Zn2+, pH 5,7 (2); B) 0,1 M KNO + 5x103 M Hg2+ + 1x10-33 3 M Zn2+ + 1x10-3 M Cu2+ , pH 5,7 desde 1,2 hasta -1,2 a 200 mV s-1 Esto se debe a la formación de compuestos ínter metálicos como, la curva de calibración que se obtiene a partir de los en la amalgama de mercurio. La formación de estos valores de ip vs concentración de iones Zn(II). Se muestra compuestos ínter metálicos constituye una interferencia que la corriente del pico de reducción del complejo es importante para la determinación de iones Zn(II) o iones proporcional con la concentración de iones Zn(II). Cu(II) debido a que las aleaciones formadas se comportan como un compuesto químico con características particula- Dado que los iones Zn(II) son adsorbidos y precon- res y no se redisuelve de igual forma que el metal puro. centrados en la monocapa autoensamblada a través de la formación de un complejo metálico en lugar de ser Comportamiento electroquímico del zinc en un electrodo preconcentrados por su deposición al potencial de de DTNB/Au. La figura 3 muestra la familia de reducción reversible de Nernst, el potencia de reducción voltamperogramas registrados por VOC en una solución del complejo metálico es más positivo y la corriente de buffer fosfato pH 7,2 libre de iones Zn(II), una vez que el reducción más sensible a la concentración de iones electrodo modificado con el ácido DTNB fue sumergido metálicos. Este comportamiento permite la cuantificación en una solución acuosa de concentración variable de iones de iones Zn(II) en un intervalo de potencial donde el medio Zn(II) aplicando un potencial de +0,60 V durante 30 s, así electrolítico no se descompone. 8 S Menolasina, A De Santis, F Díaz, A Sánchez, A Aguilar, O Contreras /Avances en Química 5(1), 3-14 (2010) A pH = 4,2 (figuras 4A) se observa que el pico de oxidación del cobre depositado a potenciales más negativos que E ored comienza a definirse y hacerse proporcional a la concentración de iones Cu (II) cuando la misma es > 1,5x10-4 M y < 4,8x10-4 M (figura 4b). El limite detección (LD) obtenido fue de 140 µM para Cu (II). Figura 3: Familia de voltamperogramas obtenido por VOC en solución buffer fosfato (solución blanco = SB) libre de iones Zn(II) pH 7,2 después de haber colocado el electrodo de oro modificado con DTNB en: 1) SB; 2) SB + 4x10-5 M Zn(II); 3) SB + 8x10-5 M Zn(II); 4) SB + 10x10-5 M Zn(II); 5) SB + 12x10- 5 M Zn(II); 6) SB + 15x10-5 M Zn(II); 7) SB + 20x10-5 M Zn(II); 8) SB + 25x10-5 M Zn(II), durante 30 s aplicando un potencial Figura 4A: Familia de voltamperogramas obtenidos por de +0,6V. VOCDA en una solución reguladora acético/acetato (pH = 4,2) Efectos electrostáticos con un electrodo de oro modificado después de su inmersión en solución reguladora acético/acetato (pH = 4,2) de concentración Otro factor que puede influenciar el comportamiento variable en iones Cu(II) y aplicación de un potencial de -0,25 V electroquímico de sustancias de interés medico y durante un tiempo determinado. farmacológico cuando se emplean electrodos modificados son las fuerzas de atracción o repulsión que se desarrollan entre la superficie electródica modificada y la sustancia electroactiva de interés (factor electrostático). Comportamiento electroquímico del cobre en un electrodo de tiol I/Au. Cuando el electrodo de oro modificado con el tiol I se sumerge en una solución reguladora + Cu (II) a pH = 4,2 ó 7,2, durante un determinado tiempo a circuito abierto y luego es utilizado en una solución blanco donde se le aplica primero un potencial de -0,25 V durante un determinado tiempo y luego un barrido de potencial en la dirección anódica por VOC, no se observa ningún pico de oxidación del metal. Estos resultados indican que en el electrodo modificado no se pueden preconcentrar los iones Cu(II) a circuito abierto a través de las interacciones de los grupos funcionales presentes en el tiol con los iones metálicos. En cambio, cuando dicho electrodo modificado Figura 4B: Curva de calibración con los datos obtenido en de ip se introduce en una solución reguladora + Cu(II) de vs concentración de Cu(NO3)2 de la figura 4A. concentración variable a pH = 4,2 ó 7,2, y se le aplica un potencial de -0,25 V durante un determinado tiempo y A pH = 7,2 (figura 5A) se observa que el pico de la luego se coloca en una solución blanco y se realiza un redisolución de la monocapa de cobre a potenciales menos barrido de potencial en la dirección anódica, se observa el positivos que E ored comienza a definirse y hacerse comportamiento descrito en las figuras 4A, 4B, 5A y 5B. proporcional a la concentración de iones Cu(II) cuando la S Menolasina, A De Santis, F Díaz, A Sánchez, A Aguilar, O Contreras /Avances en Química 5(1), 3-14 (2010) 9 misma es ≥ 1x10 -5 M y < 6x10-5 M (figura 5B). El LD fue de 8 µM para Cu(II). Y = Ax +B 2.0x10-5 Estos resultados muestran que la transferencia electrónica 1.8x10-5 -6 sobre el sensor electroquímico tiol I/Au no es bloqueada A =2,88x10-5 completamente y se ve afectada por la naturaleza de la 1.6x10 B = 0,4096-5 carga de las especies redox y por la carga parcial que se 1.4x10 R = 0,99883-5 origina en la monocapa autoensamblada del tiol en función 1.2x10-5 del pH de la solución de acuerdo a los resultados obtenidos 1.0x10 por Menolasina et.al.21 en 2009. 8.0x10-6 6.0x10-6 1.0x10-52.0x10-53.0x10-54.0x10-5 [Cu(NO3)2/]/mol L -1 Figura 5B: Curva de calibración con los datos obtenido en de ip vs concentración de Cu(NO3)2 de la figura 5A. Comportamiento electroquímico de la DA en un electrodo de tiol II/Au. En la figura 6 se muestra el comportamiento de la oxidación de DA en presencia de AA cuando se utiliza, un electrodo de oro modificado químicamente con una película de ácido 2-N-metil-1-ciclopenten-1- ditiocarboxílico (tiol II/Au). Se observó que la señal de oxidación de DA en el tiol/Au se ha desplazado 0,28 V y la de AA 0,15 V hacia valores más positivos con respecto Figura 5A: Familia de voltamperogramas obtenidos por a las señales de oxidación de estos compuestos en el VOCDA en una solución reguladora acético/acetato (pH = 7,2) electrodo de oro sin modificar. Este comportamiento con un electrodo de oro modificado después de su inmersión en sugiere que la monocapa adsorbida del tiol II, actúa como solución reguladora acético/acetato (pH = 7,2) de concentración variable en iones Cu(II) y aplicación de un potencial de -0,25 V una barrera para la oxidación de DA en mayor proporción durante un tiempo determinado. con respecto a la oxidación del AA. A pH 5,1 la DA se encuentra en su forma catiónica y el AA en su forma aniónica, lo que implica que el efecto de bloqueo para la oxidación de DA es más pronunciado debido a que al pH de la solución buffer la monocapa adsorbida está cargada 4,0x10-4 B F 4,0x10-4 8,0x10-4 Y = A + BXI E 3,6x10-4A 3,0x10-4 D -4 A = 1,3897x10-4 4,0x10-4 II 3,2x10 C B = 0,37156x10-7 2,8x10-4 0,0 2,0x10 -4 B II2,4x10-4 -4 2,0x10 -4 R = 0,9998; SD = 1,44887x10 -6 -4,0x10-4 1,0x10 A 1,6x10-4 200 400 600 800 -8,0x10-4 0,0 E/V vs. Ag/AgCl(sat)0,0 0,4 0,8 0,0 0,4 0,8 E/V vs. Ag/AgCl(sat) E/V vs. Ag/AgCl(sat) Figura 6: Voltamperogramas obtenidos en una solución buffer acetato pH 5,1 con: A) I. Un electrodo de oro sin modificar y II. Con un electrodo de oro modificado químicamente con ácido N-metil-1-ciclopenten-2-ditiocarboxilico en presencia de 640 µM DA + 1000 µM AA; ν = 200 mV s-1. B) Voltamperogramas obtenidos por VOC en presencia de 1000 µM AA y concentraciones variables de DA: 240; 320; 480; 560 y 640 µM; frecuencia: 60 Hz y amplitud: 25 mV. II) Comportamiento de la densidad de corriente de pico con la concentración de DA en presencia de 1000 µM AA (datos tomados de B). J/A cm-2 j/A cm-2 i/A j/A cm -2 10 S Menolasina, A De Santis, F Díaz, A Sánchez, A Aguilar, O Contreras /Avances en Química 5(1), 3-14 (2010) positivamente ejerciendo una repulsión electrostática con las moléculas de DA (efectos electrostáticos). Sin electrodo sin modificación embargo, esta modificación permite la cuantificación de la -5 electrodo modificado con laponita DA en presencia de AA debido a que la monocapa de tiol 3,0x10 adsorbida evita el envenenamiento de la superficie del -5 electrodo con productos de la oxidación de la DA y del 2,0x10 AA. -5 Comportamiento electroquímico de la DA en un electrodo 1,0x10 de LAP/CV. En la figura 7 se muestra la respuesta electroquímica de la DA en un electrodo de CV 0,0 modificado con LAP (LAP/CV). Se observa que la señal de oxidación de la DA se hace menos reversible en el -1,0x10-5 sensor electroquímico de LAP/CV con respecto al electrodo desnudo. Sin embargo la corriente de oxidación -2,0x10-5 se incrementa, lo que hace suponer que por ser la LAP una -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 arcilla de intercambio cationico y la DA una especie E/V vs. Ag/AgCl cargada positivamente a pH 6, de acuerdo a resultados obtenidos en otro trabajo12 se produce una preconcen- tración de la misma cerca de superficie electródica por Figura 7: Voltamperogramas obtenidos en una disolución 5x10 -4 efectos electrostáticos incrementándose por lo tanto la M DA en tampón de fosfato sódico pH 6,0 utilizando un corriente de oxidación. electrodo de carbón vítreo sin modificar y modificado con laponita y modificado con laponita/GA; ν = 200 mV s-1. 16000 Y = A + B * X 3000 A = -12,38 y B = 28,93 12000 R R2 SD N ----------------------------------------- 2000 0,9997 0,9994 22,0103 35 8000 1000 4000 0 0 20 40 60 80 100 [Dopamina] (mM) 0 0 500 1000 1500 2000 2500 E/V vs. Ag/AgCl Figura 8: Comportamiento del biosensor GA /LAP-TIROS/CV con la concentración de DA. Efectos difusionales primer orden o comportamiento michaeliano con respecto a la concentración del sustrato. La forma de hacerlo es Comportamiento electroquímico de la DA en un electrodo determinado el coeficiente de cooperatividad de Hill (η) a de GA/LAP-TIROS/CV (biosensor enzimático amperomé- través de la siguiente ecuación: trico). En la figura 8 se muestran la curva de calibración de η la DA que se obtiene con el biosensor GA/LAP- imax [S ] TIROS/CV. Una forma de averiguar si la reacción ik = η (1) K + [S ] enzimática que se desarrolla en el biosensor de DA está M siendo afectada por efectos difusionales consiste en donde ik es la corriente de estado estacionario de un determinar si dicha reacción sigue o no una cinética de biosensor amperometrico bajo control cinético, imax es la i (nA) i (nA) i(A) S Menolasina, A De Santis, F Díaz, A Sánchez, A Aguilar, O Contreras /Avances en Química 5(1), 3-14 (2010) 11 máxima corriente que se obtiene cuando [S]»KM y KM es la Este valor es indicativo de una cinética de primer orden, constante aparente de Michaelis-Menten23. por lo tanto, la respuesta del biosensor no se ve afectada La ecuación (1) puede expresarse como: por efectos difusionales y parámetros cinéticos como la constante de Michaelis-Menten y Velocidad máxima ik [ ] pueden ser determinados. log =η log S − log K (2) i Mmax − ik Comportamiento electroquímico de la glucosa en un electrodo de MD/PAA-GOx /Pt (biosensor enzimático i Al graficar log k vs. log[S ] (figura 9) se puede amperometrico). El uso de microgeles como soporte para imax − ik atrapar enzimas presenta una serie de ventajas entre las observar que η es aproximadamente igual a 1. cuales se tiene que la enzima es protegida contra contaminación y biodegradación debido a la matriz polimérica que conforma al microgel. Esto se traduce en Y = -2.819 + 1.126 * X un incremento del tiempo de vida media del biosensor -------------------------------------------------- -0.,4 R SD N enzimático. Sin embargo dependiendo de la cantidad del -------------------------------------------------- microgel que se coloque en la superficie electródica la 0.99941 0.0192 30 -0.,8 ------------------------------------------------- respuesta del biosensor puede ser influenciada o no por efectos difusionales internos. --1.,2 En la figura 10 se muestra el comportamiento que exhiben --1.,6 cuatro biosensores que se construyeron a partir de microgeles de PAA-GOx variando la cantidad que se --2.,0 deposita de estos sobre la superficie del electrodo. Se observa que a medida que aumenta la cantidad en mg de --2.,4 microgeles sobre la superficie del electrodo incrementándose por ende la carga enzimática, la zona que -2.,8 en teoría es controlada por la cinética de la reacción se 00,0 00.,44 00.,88 11,.22 11,.66 22,.00 amplia y la zona de saturación en donde la corriente del log[DA] M biosensor es independiente de la concentración del sustrato (µ ) se alcanza más rápidamente cuando la cantidad del microgel se disminuye sobre la superficie del electrodo debido a que más rápidamente los sitios activos de la i Figura 9: Comportamiento del log k vs. log[S ] enzima son ocupados por el sustrato. A bajas i − i concentraciones del sustrato donde en teoría la reacción es max k 100 80 60 1 mg de deposito 1,5 mg de deposito 40 2 mg de deposito 3 mg de deposito 20 0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 [Glucosa] (mM) Figura 10: Comportamiento de la corriente relativa en función de la concentración de glucosa al usar diferentes cantidades de microgeles de PAA-GOx log( iK/imax - iK) Corriente maxima relativa (%) 12 S Menolasina, A De Santis, F Díaz, A Sánchez, A Aguilar, O Contreras /Avances en Química 5(1), 3-14 (2010) Efectos difusionales Limitan la disponibilidad de sustrato para la reacción enzimática E [P1] [S] L Limitan la disponibilidad del E producto de la reacción C [Ss] enzimática para la reacción T [S1] electroquímica R [S2] [P] O D Este tipo de limitaciones O [Ps] hace que se reduzca la velocidad de la reacción y [P2] aumente la KM para el sustrato C2 Microgel C1 Seno de la Solución Membrana Punto enzima de diálisis crítico Figura 11: Efectos microambientales de difusión que se pueden desarrollar en la superficie de un biosensor amperométrico construido utilizando microgeles y membrana de diálisis como soporte de la enzima gobernada por la cinética de la reacción enzimática el La figura 11 muestra una representación esquemática de orden de la reacción debería ser 1 si no existen efectos los efectos microambientales de difusión que se pueden difusionales. desarrollar en la superficie de un biosensor amperométrico i construido utilizando como soporte de la enzima Al graficar log k vs. log[S ], a partir de los datos microgeles. imax − ik obtenidos con cada biosensor (figura 10), se pudo observar Conclusiones que los valores obtenidos de η se alejan considerablemente La modificación de superficies de carbón vítreo con una de 1, estos valores nos indican que la reacción enzimática película de mercurio mejora la sensibilidad del análisis de en cada uno de los biosensores está siendo afectada por metales trazas debido a que permite preconcentrar al metal diversos procesos que están ocurriendo en la cercanía de la en dicha película formando una amalgama. Sin embargo la interfase electrodo/solución. Por ejemplo, se esperaría que formación de compuestos ínter metálicos entre el metal de el coeficiente de Hill se aproxime a 1 cuando la cantidad interés y otros sobre la superficie de mercurio limita su uso de microgeles que se deposita es pequeña debido a que los como sensor electroquímico. efectos difusionales internos deben ser mínimos al disminuir la resistencia del sustrato a difundir por la matriz El uso de materiales tales como arcillas y tioles como sólida que conforma la cantidad de microgeles modificadores de superficies electródicas permite la depositados. Sin embargo pueden ser otros los efectos que interacción del analito con los grupos funcionales del estarían gobernando dicho proceso. Al tener una menor material depositado y la posible formación de complejos cantidad de microgeles, estos van a estar rodeados por más que pueden ser reducidos electroquímicamente, asi como, cantidad de líquido. Las condiciones microambientales la formación de densidades de carga parciales ya sean alrededor del microgel cambian de tal forma que se positivas o negativas sobre la superficie del sensor establecen gradientes de concentración alrededor de dichas electroquímico haciendo que por efectos electrostáticos se partículas ocasionando un efecto sobre la velocidad de separe o amplifique la señal electroquímica de la sustancia reacción. de interés. S Menolasina, A De Santis, F Díaz, A Sánchez, A Aguilar, O Contreras /Avances en Química 5(1), 3-14 (2010) 13 El desarrollo de cargas opuestas entre el sensor 6. J Justice, A Jaramillo. Selectivity and kinetics of catechol- GA/LAP/CV y el analito DA en soluciones buffer pH 6 amine oxidation at modified carbon paste electrodes. J. permite incrementar la sensibilidad para la determinación Electrochem. Soc., 131, C106-C106 (1984). y cuantificación de DA. A pH 5,1 la DA se encuentra en su 7. H Zhao, Y Zhang, Z Yuan Z. Determination of Dopamine in forma catiónica y el AA en su forma aniónica. the Presence of Ascorbic Acid Using Poly(hippuric acid) El sensor electroquímico tiol II/Au (con carga parcial Modified Glassy Carbon Electrode. Electroanalysis, 14, 1031-1034 (2002). positiva) permite separar las señales de oxidación de DA y de AA debido a efectos electrostáticos y evita además el 8. A Ciszewski, G Milczarek. Polyeugenol-modified platinum envenenamiento de la superficie del electrodo con electrode for selective detection of dopamine in the presence productos de la oxidación de DA y de AA. of ascorbic acid. Anal. Chem., 71, 1055-1061 (1999). El uso de la matriz laponita-glutaraldehido sin membrana 9. B Duong, R Arechavaleta, N Tao. In situ AFM/STM charac-terization of porphyrin electrode films for electrochemical de diálisis para atrapar la enzima tirosinasa (biosensor GA detection of neurotransmitters. J. Electroanal. Chem., 447, /LAP-TIROS/CV) reduce al mínimo los efectos 63-69 (1998). difusionales haciendo posible la determinación de la KM de la reacción enzimática. 10. A Fragoso, E Almirall, R Cao, L Echegoyen, R González. A supramolecular approach to the selective detection of En el biosensor enzimático a base de microgeles dopamine in the presence of ascorbate. Chemical soportados con membrana de diálisis (MD/PAA-GOx /Pt) Communications, 19, 2230-2231 (2004). para la cuantificación de glucosa, los efectos difusionales 11. S Menolasina, R Contreras, A Aguilar, O Contreras, A externos e internos afectan considerablemente las Rodríguez. Comportamiento electroquímico de la dopamina propiedades cinéticas de la reacción enzimática haciendo en presencia de ácido ascórbico utilizando un electrodo de imposible la determinación de la KM de la reacción oro modificado electroquímicamente y un electrodo de oro enzimática. modificado electroquimicamente y químicamente con un tiol. Revista Técnica. Ing. Univ. Zulia, 30(2), 151-157 (2007). Agradecimientos 12. S Menolasina, B Martín-Fernández, F García-Iñigo, B Los autores agradecen a las doctoras Beatriz López Ruiz y López-Ruiz. Comportamiento electroquímico de la dopamina Martas Sánchez-Paniagua López de la Sección Departamental de en un electrodo de carbón vítreo modificado con Laponita/ Química Analítica, Facultad de Farmacia, Universidad Complu- Glutaraldehido. An. R. Acad. Nac. Farm., 75(3), 373-388 tense de Madrid, España y al doctor Ricardo R. Contreras del (2009). laboratorio de Órganometálicos de la Escuela de Química de la 13. G Alarcón-Angeles, S Corona-Avendaño, M Palomar- Facultad de Ciencias de la Universidad de Los Andes, Mérida, Pardave, A Rojas-Hernández, M Romero-Romo, M Ramírez- Venezuela, por su asesoramiento en algunos experimentos Silva. Selective electrochemical determination of dopamine realizados y por su colaboración en el suministro de ciertos in the presence of ascorbic acid using sodium dodecyl sulfate compuestos orgánicos utilizados como modificadores de las micelles as masking agent. Electrochimica Acta, 53(6), superficies electródicas. Así como también al CDCHT-ULA 3013-3020 (2008) (FA-430-08-08-B) y FONACIT Venezuela por la financiación de este trabajo. 14. J Hervás-Pérez, M Sánchez-Paniagua, E López-Cabarcos, B López-Ruiz. Amperometry tyrosinase biosensor based on Referencias polyacrilamidemicrogels. Biosensors and Bioelectronics, 22(33), 429-439 (2006). 1. S Menolasina. Fundamentos y Aplicaciones de Electro- química, Consejo de Publicaciones ULA, Mérida (2004). 15. P O’Connell, G Guibault. Future Trends in Biosensor research. Analytical Letters, 34, 1063-1078 (2001). 2. L Serra, J Aranceta, J Mataix. Nutrición y Salud pública. Métodos, bases científicas y aplicaciones. 2da edición. 16. M Pravda, M O’Halloran, M Kreuzer, G Guilbault. ELSEVIER-MASSON (2006). Composite glucose biosensor based on screen-printed electrodes bulk modified with Prussian blue and glucose 3. D Vallone, R Picetti, E Borrelli. Structure and function of oxidase. Analytical Letters, 35, 959-970 (2002) dopamine receptors. Neurosc. Biobehav. Rev., 24, 125-32 (2000). 17. B Piro, V Do, L Le, M Hedayatullah, M Pham. Electrosyn-thesis of a new enzyme-modified electrode for the ampere- 4. A Boulton, G Baker, R Adams. Voltammetric Methods and metric detection of glucose. Journal of Electroanalytical rain Systems. The Humana Press, Clifton, NJ (1995). Chemistry, 486, 133-140 (2000). 5. F Gonon, M Buda, J Pujol. Measurements of Neurotrans- 18. I Popescu, S Cosnier, P Labbé. Peroxidase-glucose oxidase- mitter Release in Vivo. En: Marsden C.A., Editor, Wiley, poly(amphiphilic pyrrole) bioelectrode for selectively media- Chichester, 153-167 (1984). ted amperometric detection of glucose. 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