53 www.saber.ula.ve/avancesenquimica Avances en Química, 4(2), 53-62 (2009) Artículo Científico Validación de un método analítico para la determinación de magnesio eritrocitario Raibel Suarez, Evelia Arévalo, Ledy Linares, Francisco Ustáriz y Gladys Hernández Laboratorio de Análisis Instrumental de la Escuela de Bioanálisis, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, Universidad de Los Andes, Mérida 5101-Venezuela (*) eveliaa@ula.ve Recibido: 17/03/2009 Revisado: 29/04/2009 Aceptado: 27/05/2009 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ Resumen: El objetivo de este trabajo es efectuar la validación de un método para la determinación de magnesio eritrocitario mediante espectrofotometría de absorción atómica con llama. En el proceso de validación se estimaron los valores para los parámetros que determinan el rendimiento del método como son: linealidad, límite de detección, límite de cuantificación, exactitud y precisión. Se demostró que el método validado cumple con los niveles de aceptación establecidos por las normas nacionales e internacionales relacionadas con la calidad en el laboratorio, y aseguran que el método es adecuado para ser aplicado en el análisis de magnesio eritrocitario en pacientes con diferentes patologías. Palabras clave: validación; método; magnesio; absorción atómica; eritrocitos. Abstract The purpose of this study is to validate a method for determining erythrocyte magnesium by flame atomic absorption spectrometry with flame. During the process of validation values were estimated for the parameters that determine the performance of the method, such as: linearity, detection limit, limit of quantification, accuracy and precision. It was shown that the validated method meets the performance levels set by national and international standards related with the quality in the laboratory and ensures that the method is suitable for application in the analysis of erythrocyte magnesium in patients with different pathologies. Keywords: validation; method; magnesium; atomic absorption; erythrocyte. Introducción normalizadas para la ejecución de los métodos analíticos y El objetivo de un laboratorio clínico es suministrar datos evitar así que diferentes laboratorios que trabajan con la que contribuyan al diagnóstico de enfermedades, su misma muestra, la misma metodología analítica y con prevención y terapéutica, para ello es necesario utilizar personal capacitado, obtengan resultados con una métodos analíticos confiables, precisos y adecuados para variabilidad muy amplia. Entre estas normas se encuentran este fin. Por lo tanto, para la determinación de un analito, las emitidas por la Organización Internacional de cualquiera sea la metodología a implementar, se requiere Normalización (ISO) que a nivel específico del laboratorio la optimización de las condiciones experimentales que clínico comprenden la Guía ISO/IEC 17025:1999 determinan la eficiencia del ensayo, debido a que éstas “Requisitos generales relativos a la competencia de los presentan variaciones en función de las características laboratorios de ensayo y calibración”, norma homologada propias de cada equipo y de los requerimientos en Venezuela como norma COVENIN 2534-2000, y la operacionales del laboratorio donde se llevará a cabo la norma ISO 15189-2003 “Laboratorios médicos: Requisitos medición. particulares relativos a la calidad y competencia”, igualmente está la norma COVENIN 2972-2:1997 A los efectos se han emitido una serie de guías, normas y correspondiente a la homologación de la norma ISO 5725- reglamentos que buscan imponer condiciones 2:1994, entre otras normas. 54 R. Suarez, E. Arévalo, L. Linares, F. Ustáriz, G. Hernández /Avances en Química 4 (2), 53-62 (2009) Para asegurar la confiabilidad de los resultados, los intracelular ha sido medido en células rojas o eritrocitos, métodos analíticos deben someterse a un proceso de dado que estas células representan el compartimiento validación. En general, todos los métodos a utilizar en un subcelular más grande de las células sanguíneas. laboratorio han de estar validados, ya que ello garantiza la calidad de los resultados. Según la norma ISO/IEC: 17025, En este trabajo se obtienen en forma experimental y para los laboratorios deben validar todos los métodos que se las condiciones particulares del Laboratorio de Análisis utilicen en un laboratorio, tanto los desarrollados por ellos Instrumental de la Escuela de Bioanálisis de la mismos como aquellos procedentes de fuentes Universidad de Los Andes, de acuerdo con las normas bibliográficas o desarrollados por otros laboratorios1. nacionales e internacionales de estandarización de métodos analíticos, los parámetros (linealidad, límite de detección, Entre los analitos que se determinan en un laboratorio límite de cuantificación, sensibilidad, exactitud, precisión clínico y que requieren del suministro de datos seguros y y estudios de interferencias por adición estándar) que confiables se encuentra el magnesio: cuarto catión más servirán como criterios de confianza del método a utilizar abundante en el organismo humano y el segundo catión para la determinación de magnesio en células rojas por más importante en el compartimiento intracelular2. espectrofotometría de absorción atómica con llama, previo El magnesio se encuentra dentro de todos los tejidos del tratamiento de la muestra por desproteinización. cuerpo, e interviene en prácticamente todos los órganos y Este método podrá aplicarse una vez validado para la sistemas: sistema nervioso, sistema cardiovascular, hígado, determinación de este analito en muestras de pacientes con huesos, sistema digestivo, sistemas inmunológicos y en los distintas patologías. mecanismos de óxido-reducción3. El magnesio participa en la maduración de los reticulocitos, es un factor Parte experimental determinante en el metabolismo de la glucosa y la insulina. Materiales y reactivos: se utilizaron los siguientes Como catión divalente, el magnesio tiene gran influencia reactivos, todos de grado analítico: cloruro de sodio sobre el metabolismo mineral, se considera que el (Merck), ácido clorhídrico (Allied Signal), ácido contenido de este elemento puede ser un factor muy tricloroacético anhídrido (Merck), sulfato de magnesio importante en los cambios cuantitativos de la matriz ósea, hexahidratado (Riedel-De Haënag Seclze-Hannover), además, diversos estudios relacionan este elemento como cloruro de lantano (Sigma), solución salina al 0,9 %. Para probable factor involucrado con la pérdida de la masa la preparación de todas las soluciones se utilizó agua ósea, debido a su ingesta deficiente o a un desequilibrio en 4 desmineralizada y desionizada (Milipore) con una la absorción . También juega un papel importante en la resistividad específica de 18 Ω cm. El material de vidrio de contracción muscular, la disminución de magnesio puede uso común en el laboratorio fue previamente lavado con traer como resultado una hipertensión, espasmos 5 agua y detergente y luego se enjuagó con ácido nítrico al musculares, coronarios y cerebrales . 10% y con agua desionizada. Para la determinación del magnesio en el organismo Equipos: espectrofotómetro de absorción atómica con humano, generalmente se utiliza la espectrofotometría de atomización en llama Perkin Elmer, modelo 3110. Se absorción molecular, sin embargo, la espectrofotometría de utilizó una lámpara de cátodo hueco monoelemental de absorción atómica es una técnica rápida, con alta exactitud Mg. y precisión que también puede ser utilizada. Tratamiento de las muestras: se realizó basándose en el En lo que se refiere al espécimen utilizado para detectar las método propuesto por Prasad y colaboradores en 196515, alteraciones de la homeostasis del magnesio en el para determinar concentraciones de cinc eritrocitario: organismo, generalmente se utiliza suero sanguíneo6, aun Utilizando tubos al vacío heparinizados Vacuum cuando en éste solamente se encuentra el 1% del contenido Diagnostics®. y agujas Vacutainer® se extraen 8 mL de total de este ion en el organismo7. sangre heparinizada. Mediante centrifugación a 2500 g Considerando que el 99% de la carga corporal del durante 10 minutos se obtiene la separación del plasma y magnesio es intracelular, la determinación de magnesio del paquete celular. El plasma se remueve, mientras que intracelular puede ser un buen indicador del estado del del paquete celular se elimina la capa blanca mediante magnesio en distintas patologías8,9,10. Así por ejemplo, las succión y se deja la fase roja, contentiva de eritrocitos. Los células sanguíneas se han utilizado para determinar los eritrocitos obtenidos se lavan tres veces, utilizando 4 mL niveles de magnesio en pacientes con diabetes11, en de solución salina 0,9% por cada mL de eritrocitos o pacientes con hipertensión primaria12, en pacientes con glóbulos rojos, se mezcla y centrifuga durante 5 minutos a preeclampsia13, en pacientes con asma14, entre otras 2500 g, y se descarta el sobrenadante. Luego se hemolizan patologías y particularmente el contenido de magnesio los glóbulos rojos, con agua desionizada (1 mL de R. Suarez, E. Arévalo, L. Linares, F. Ustáriz, G. Hernández /Avances en Química 4 (2), 53-62 (2009) 55 glóbulos rojos más 2 mL de agua desionizada), mediante En la Figura 1, se muestra la curva de Ringbom obtenida fuerte agitación utilizando un Vortex Mixer, modelo VM con estos datos. 1000. Posteriormente se efectúa la desproteinización utilizando 2 mL de los glóbulos rojos hemolizados, 2 mL de agua desionizada, 1 mL de HCl 6 N y 1 mL de ácido tricloroacético al 20%; la mezcla se lleva a Baño de María a 90 ºC durante 5 minutos. Una vez que las muestras vuelven a la temperatura ambiente se centrifugan a 2500 g durante 10 minutos y se separa el sobrenadante en tubos de vidrio pyrex de 15 ml para su lectura inmediata. Por razones de tiempo en algunos casos se guardaron muestras en tubos plásticos y se congelaron para ser leídas al día siguiente. Básicamente la modificación del método de Prasad y colaboradores se encuentra en que aquí los eritrocitos se lavan tres veces (Prasad y colaboradores no especifican en su trabajo cuantas veces los lavaron) y principalmente en Figura 1. Curva de Ringbom para determinaciones de magnesio que en el tratamiento de la muestra solo se realiza una fase en glóbulos rojos. de desproteinización a diferencia de Prasad y colaboradores que realizaron este proceso en tres fases, La parte lineal de esta gráfica permite obtener el intervalo recogiendo tres filtrados, ya que se comprobó que se de concentraciones óptimo o el intervalo que presentará obtienen los mismos resultados al realizar una sola fase de una relación lineal entre absorbancia y concentración. De desproteinización y utilizar este solo filtrado o recogiendo acuerdo con la Australian Pesticides and Vetherinary tres filtrados como lo hizo Prasad. La modificación Medicines Authority (APVMA)17, la linealidad debe ser realizada ahorra tiempo y reactivos. establecida mediante una inspección visual y debe Determinación analítica: las determinaciones de magnesio observarse que el comportamiento de la respuesta analítica se realizaron de acuerdo con las condiciones estándares y está en función de la concentración del analito. Por lo el procedimiento señalado en el manual del tanto, al evaluar la curva de Ringbom se puede observar espectrofotómetro de absorción atómica Perkin Elmer que el comportamiento lineal se limita hasta una 311016. Para ello se utilizó 1 mL del sobrenadante y se concentración de aproximadamente 1,30 mg/dL. hizo una dilución 1:50 con cloruro de lantano al 0,1%. Ahora bien, dado que el procedimiento analítico establecido en el manual del espectrofotómetro Perkin Resultados y discusión Elmer 311016 requiere realizar una dilución de la muestra Determinación de las características de desempeño del 1:50 con cloruro de lantano, y los valores de referencia método. citados en la literatura están comprendidos entre 4,01 mg/dL y 6,04 mg/dL18 y ante la necesidad de preparar una Linealidad: curva de calibración con valores por debajo y por encima Para determinar el intervalo de concentraciones en que el del intervalo de referencia, se consideró suficiente y más sistema cumple la ley de Beer, o el intervalo óptimo de práctico trabajar con una curva de calibración cuyo concentraciones, se procedió primero a construir la curva de intervalo de concentraciones estuviera entre 0,05 mg/dL y Ringbom. Para ello se prepararon una serie de soluciones 0,175 mg/dL; de manera que tomando esto en patrones acuosos con concentraciones de magnesio consideración así como la linealidad que se observa en la comprendidas entre 0,5 mg/dL y 3,5 mg/dL. Estos patrones curva de Ringbom, se procedió a elaborar la curva de se calcularon y prepararon de manera que sus calibración midiendo la señal de la respuesta para una serie concentraciones fueran equivalentes a esas mismas de soluciones patrones del analito con las siguientes concentraciones en los glóbulos rojos sanguíneos. concentraciones 0,05 mg/dL, 0,075 mg/dL 0,10 mg/dL, 0,125 mg/dL, 0,150 mg/dL, 0,175 mg/dL. Para obtener la Se utilizó como solvente solución de cloruro de lantano al concentración verdadera en las muestras reales es 0,1%. Se preparó también una solución blanco con cloruro necesario hacer la corrección de la dilución 1:50. de lantano al 0,1% más los reactivos presentes en la muestra a analizar, de acuerdo con el tratamiento de la Para la construcción de la curva de calibración se siguieron misma. las recomendaciones de Taylor 19: 56 R. Suarez, E. Arévalo, L. Linares, F. Ustáriz, G. Hernández /Avances en Química 4 (2), 53-62 (2009) - Se prepararon seis soluciones patrones con Asimismo, se realizó el análisis de varianza de la regresión concentraciones espaciadas en forma uniforme a lo largo lineal, se determinó el test de proporcionalidad (t de del intervalo de concentración de interés, según la curva student para el intercepto) y el test de linealidad de Ringbom. El intervalo de concentración abarcó (Coeficiente de variación (C.V.) de los factores de valores por debajo, entre y sobre el intervalo lineal. respuesta F y t de student para la pendiente). - Las soluciones patrones se prepararon y leyeron por Los criterios de aceptación tomados en consideración triplicado. El procedimiento se repitió en forma fueron: independiente, tres veces para evaluar estadísticamente la regresión lineal del sistema. - Coeficiente de correlación de la regresión lineal debe encontrarse entre 0,98 y 1,00, el coeficiente de - Con el promedio de los datos obtenidos se procedió a determinación (coeficiente de correlación al cuadrado) realizar la curva de calibración mediante un análisis de debe ser mayor de 0,95. regresión por el método de los mínimos cuadrados y se determinaron las características de desempeño del - Coeficiente de variación de los factores de respuesta método en estudio. En la Figura 2 se muestra la curva CVf menor del 5% ajustada para la determinación de magnesio en glóbulos - Pendiente distinta de cero (texp.mayor que ttabla) rojos por espectroscopia de absorción atómica con llama. - Intercepto cercano a cero (texp. menor que ttabla) Los cálculos se realizaron y analizaron utilizando Microsoft Excel 2003, obteniéndose los siguientes resultados: Coeficiente de correlación (r): 0,9996 Coeficiente de determinación (r2): 0,9993 Los resultados obtenidos indican que el modelo ajustado es capaz de explicar la respuesta (absorbancia) a partir del uso de la variable concentración. De manera que, en el intervalo de concentración comprendido entre 0,050 mg/dL a 0,175 mg/dL, se satisfacen las condiciones de linealidad del método analítico, ya que, se cumplen los requerimientos de un coeficiente de determinación lineal (r) mayor que 0,98 y de un coeficiente de determinación (r2): mayor de 0,95, lo que indica correspondencia entre los valores obtenidos con la recta de ajuste y los obtenidos experimentalmente. Figura 2. Curva de regresión para la determinación de magnesio por espectroscopia de absorción atómica con llama. Por otra parte el análisis de varianza permitió determinar que el valor F calculado = 7391,63 es mayor al valor F Existen tres maneras de verificar el intervalo de crítico = 4,03, indicativo de que el modelo lineal se ajusta concentraciones para el cual el modelo lineal es válido, para la relación entre la absorbancia a partir de la ninguna de ellas excluye a la otra: la primera es la concentración con un nivel de significación del 5%. investigación del gráfico de residuos (yi – ŷ) en función de Simultáneamente, se estimaron el intercepto (b = - la concentración. Otra manera de verificar la validez del 0,000429) y la pendiente (m = 0,2437), de acuerdo con modelo lineal es mediante el coeficiente de correlación (r) estos datos la ecuación ajustada es Y = 0,2437X – y el tercer método es el análisis de varianza de la 0,000429 regresión. Se comprobó la significación del intercepto con respecto al Por lo tanto, para comprobar si el modelo lineal simple se cero a través de la prueba de Student. El intercepto de la ajusta o no para estudiar la relación entre la absorbancia y recta de ajuste está cercano a cero, al aplicársele la prueba la concentración se determinó: la ecuación de la recta y se de Student se obtuvo un valor de t experimental menor que calcularon los parámetros de la pendiente, el intercepto, el el valor de t tabulado (texp =-1,35752967, ttab.=2,78) para coeficiente de correlación (r), y el coeficiente de una probabilidad del 95% y 4 grados de libertad, lo que determinación (r2), de la línea de regresión o curva de permitió establecer que no existen diferencias calibración ajustada mediante el método de los mínimos cuadrados. R. Suarez, E. Arévalo, L. Linares, F. Ustáriz, G. Hernández /Avances en Química 4 (2), 53-62 (2009) 57 estadísticamente significativas, quedando así demostrada exactitud y precisión mediante la fórmula LOQ = 10SB/m la proporcionalidad del sistema. donde el valor de la constante K es igual a 10. Mediante la prueba de linealidad se calculó el coeficiente Para la determinación del límite de detección y del límite de variación (C.V.) total de los factores de respuesta (1,67 de cuantificación se prepararon diez muestras blanco, tal %), el cual fue inferior al 5% establecido como límite como se explicó anteriormente, con cloruro de lantano al indicativo de linealidad, lo que indica que la pendiente es 0,1% más los reactivos presentes en la muestra a analizar, distinta de cero y demuestra la adecuada linealidad en el de acuerdo con el tratamiento de la misma y se realizaron intervalo de trabajo estudiado. Estos datos se muestran en las respectivas lecturas de absorbancias aplicando el la Tabla 1 método en estudio. Estas determinaciones se hicieron Tabla 1.- Test de linealidad, C.V. global de los factores de espaciadamente en el tiempo de realización de la respuesta investigación, obteniéndose los resultados siguientes: DS = 0,001 m = 0,24 X Y Factor B LOD = 0,0125 mg/mL Concentracion Absorbancia de respuesta f LOQ = 0,0416 mg/mL (mg/dL) (Y/X) 0,05 0,0117 0,234 Exactitud y precisión: 0,075 0,0176 0,235 Para estas determinaciones se tomaron en consideración los criterios y definiciones establecidos en normas 0,1 0,0234 0,234 internacionales y nacionales tales como el Vocabulario 0,125 0,0296 0,237 Internacional de Términos Básicos y Generales en Metrología (VIM), (norma venezolana COVENIN 0,15 0,0363 0,242 2552:1999)21, según la cual, la exactitud de la medición es 0,175 0,0426 0,243 una cualidad que refleja el “grado de concordancia entre el resultado de una medición y un valor verdadero de la Media = 0,2375 magnitud a medir”. Asimismo, la guía ISO 3534-1:199322, Desviacion estándar = 0,0039 define la exactitud como “la proximidad en la concordancia entre un resultado y el valor de referencia aceptado” y esta C.V. = 1,65% misma norma establece que la precisión es el grado de concordancia entre ensayos independientes obtenidos bajo unas condiciones estipuladas. Límite de Detección y Límite de Cuantificación: La exactitud del método se verifica mediante el análisis de Para la determinación del límite de detección se siguió la un material de referencia certificado, o comparando los definición de la Unión Internacional de Química Pura y 20 resultados con los resultados obtenidos por otro método Aplicada (IUPAC) adoptada en 1975, la cual establece confiable sobre la misma muestra.de no ser posible ninguno que “el límite de detección expresado como una de estos procedimientos se recurre a las pruebas de concentración (CL), o cantidad, (qL) se deriva de la medida recuperación, las cuales suministran evidencias sobre la más pequeña, (YL), que puede detectarse con razonable validez de los resultados23. La exactitud se expresa como el certeza para un procedimiento analítico dado”. porcentaje de recuperación en un método analítico de una Experimentalmente, el límite de detección (LD) se cantidad conocida del analito o como la diferencia entre el determina involucrando todos los factores que afectan la valor medio obtenido en la valoración y el valor aceptado medida y se define, en general, para obtenerlo en unidades como real. de concentración como: LOD = 3SB / m. Donde: SB = En este trabajo para el estudio de la exactitud se empleó el desviación estándar de los blancos y m.= es la pendiente de método de adición/recuperación. una curva de calibración del sistema, calculada a muy bajas concentraciones. Este criterio es recomendado por la Para la determinación de la precisión de un método, la 20 24IUPAC e igualmente la IUPAC ha sugerido que el criterio Conferencia Internacional sobre Armonización, (ICH) , para el valor de la constante K sea K = 3. Mientras que, el recomienda llevar a cabo un total de nueve límite de cuantificación (LOQ) es la concentración mínima determinaciones que cubran el intervalo especificado en el de analito que puede determinarse con un nivel aceptable de procedimiento. Para ello se trabajan tres niveles diferentes de concentración (80, 100, 120%) con tres muestras 58 R. Suarez, E. Arévalo, L. Linares, F. Ustáriz, G. Hernández /Avances en Química 4 (2), 53-62 (2009) independientes de cada nivel. Si la exactitud se evalúa por Estas soluciones se leyeron a 285,2 nm en el el método de adición estándar, se pueden obtener de una espectrofotómetro Perkin Elmer 3110 y el procedimiento vez estos datos para el análisis de la precisión. se repitió tres veces en el mismo día por el mismo analista, De acuerdo con lo antes señalado, para los estudios de en el mismo laboratorio, es decir, en condiciones de exactitud y precisión se analizó por duplicado, cuatro repetibilidad. De igual forma se repitió el procedimiento veces, un material de prueba típico (muestra de sangre en tres días diferentes con el mismo analista, a fin de completa) por el método objeto de validación y se utilizar los datos obtenidos para la determinación de la determinó el contenido promedio del analito. Una vez precisión intermedia. conocido el contenido promedio de magnesio en la La recuperación global del método se calculó a partir de la muestra real, se procedió a enriquecer la muestra, por media de las recuperaciones individuales con la siguiente triplicado, con el analito de interés a diversas ecuación: concentraciones empleando para ello soluciones patrones de concentraciones iguales a 0,050 mg/dL, 0,100 mg/dL y %R = x 100 0,150 mg/dL. Para preparar las soluciones en este caso se mantiene constante la cantidad de muestra y se agregan Donde: Y = concentración de la muestra más el patrón cantidades variables de la solución patrón. Es decir, se añadido prepararon tres soluciones que contenían cada una 1 mL de Xi= concentración inicial de la muestra muestra previamente tratada conforme al método analítico Xa= concentración del patrón añadido en estudio y se les adicionó soluciones patrones de magnesio con las concentraciones antes señaladas. En la Tabla 2 se muestran los resultados del análisis de la exactitud y de la repetibilidad del método en estudio. Tabla 2: Evaluación de la exactitud y de la repetibilidad del método en estudio MUESTRA (Xi) (Xa) (Y) % C.V. CONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓN RECUPERACIÓN % INICIAL DE LA DEL PATRÓN DE LA MUESTRA + MUESTRA AÑADIDO PATRÓN AÑADIDO (mg/dL) (mg/dL) (mg/dL) 0,065 1 0,012 0,050 0,064 0,90 0,064 104% ẋ = 0,064 0,115 2 0,012 0,100 0,111 2,74 0,109 99% ẋ = 0,111 0,164 3 0,012 0,150 0,161 1,56 0,159 99,33% ẋ = 0,161 % Recuperación global = 100,78 CV global = 1,7% Para el análisis de la veracidad a partir de los datos un criterio de aceptación de un porcentaje de recuperación obtenidos, se determinó el porcentaje de recuperación con >98%. R. Suarez, E. Arévalo, L. Linares, F. Ustáriz, G. Hernández /Avances en Química 4 (2), 53-62 (2009) 59 Para los estudios de la precisión se ha generalizado en el utilizando los resultados obtenidos para el estudio de la caso de la repetibilidad y la precisión intermedia, el uso de exactitud, y como se puede observar en la Tabla 2, se la desviación estándar relativa para evaluar la precisión del obtuvo un coeficiente de variación de 1,7% el cual se sistema o del método y el valor de la misma debe ser encuentra por debajo del 2%. menor o igual al 2%, y en algunos casos puede ser igual o 24 menor al 3%, y para la reproducibilidad puede ser 2 o 3 Además, siguiendo los criterios de la ICH , se determinó veces el valor de la repetibilidad. Por otra parte, la también la precisión tomando en consideración las lecturas repetibilidad en los valores de absorbancia de los análisis de absorbancia, para lo cual se seleccionaron soluciones intra e interdías, con valores bajos de desviación estándar con concentraciones de 0,05 mg/dL, 0,100 mg/dL y 0,150 relativa, indican que el método es preciso. Asimismo, la mg/dL y se leyeron a 285,2 nm en el espectrofotómetro de ICH24 considera aceptables valores de la desviación absorción atómica en condiciones de repetibilidad. Para la estándar relativa por debajo de 1% en análisis de determinación de la precisión intermedia (interdia) se repetibilidad (intradía) y por debajo de 2% en los análisis prepararon igualmente estas soluciones con estas mismas de precisión intermediaria (interdías). concentraciones en distintos días y se leyeron por triplicado, por el mismo analista. La recuperación media alcanzada (100,78 %) indica que el método propuesto muestra la exactitud necesaria para Los resultados de la repetibilidad se muestran en la Tabla 3 considerarlo adecuado para las determinaciones de y los resultados obtenidos para la precisión intermedia se magnesio en eritrocitos. muestran en la Tabla 4. El coeficiente de variación total calculado es de 0,53%, inferior al valor de 1% aceptable Para el estudio de la repetibilidad (precisión intradiaria), según la ICH. tal como se señaló anteriormente, el análisis se realizó Tabla 3. Resultados de la repetibilidad. MUESTRA CONCENTRACIÓN ABSORBANCIA MEDIA DESVIACIÓN COEFICIENTE DE (mg/dL) ESTANDAR VARIACION 1 0,05 0,0283 0,0286 0,0002 0,81% 0,0287 0,0287 2 0,100 0,0477 0,0477 0,0001 0,12% 0,0476 0,0477 3 0,150 0,0760 0,0761 0,0005 0,67% 0,0767 0,0757 COEFICIENTE DE VARIACIÓN PROMEDIO: 0,53 % Tabla 4. Resultados de la precisión intermedia MUESTRA 1 MUESTRA 2 MUESTRA 3 0,05 mg/dL 0,100 mg/dL 0,150 mg/dL DIA 1 : ABSORBANCIA 0,0250 0,0470 0,0720 DÍA 2: ABSORBANCIA 0,0250 0,0470 0,0730 DÍA 3: ABSORBANCIA 0,0240 0,0480 0,0730 MEDIA: 0,0247 0,0473 0,0727 DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,0006 0,0006 0,0006 COEFICIENTE DE VARIACIÓN 2,34 % 1,22 % 0,79% COEFICIENTE DE VARIACIÓN PROMEDIO = 1,45 % 60 R. Suarez, E. Arévalo, L. Linares, F. Ustáriz, G. Hernández /Avances en Química 4 (2), 53-62 (2009) El coeficiente de variación total calculado es de 1,45 %, Para completar la validación del método se realizó otro inferior al valor de 2% aceptable según la ICH24. Los ensayo para verificar la robustez del método, para ello se resultados obtenidos para la repetibilidad en los dos llevó a cabo una prueba entre días por un analista distinto. ensayos realizados y para la precisión intermedia Se prepararon por triplicado soluciones con las demuestran que el método cumple con las especificaciones concentraciones de 0,075 mg/dL, 0,125 mg/dL y 0,175 y puede ser aplicado con seguridad y eficiencia. mg/dL y se leyeron a 285,2 nm en el espectrofotómetro de absorción atómica por otro analista y en distintos días. Los resultados se muestran en la Tabla 5. Tabla 5. Resultados de la prueba de precisión entre días y con distinto analista MUESTRA 1 MUESTRA 2 MUESTRA 3 0,075 mg/dL 0,125 mg/dL 0,175 mg/dL DIA 1: ABSORBANCIA PROMEDIO 0,0390 0.0630 0,0880 DÍA 2: ABSORBANCIA PROMEDIO 0,0380 0,0630 0,0880 DÍA 3: ABSORBANCIA PROMEDIO 0,0380 0,0620 0,0870 MEDIA: 0,0380 0,0627 0,0877 DESVIACIÓN ESTÁNDAR 0,0006 0,0006 0,0006 COEFICIENTE DE VARIACIÓN 1,52 % 0,92% 0,66% COEFICIENTE DE VARIACIÓN PROMEDIO = 1,03% Estos resultados muestran que el coeficiente de variación espectrofotometría de absorción atómica en llama y en total calculado es igual a 1,03 % y está por debajo de 2% consecuencia es posible utilizar una curva de calibración aceptable según la ICH24. Estos resultados confirman lo con patrones acuosos para estas determinaciones. antes señalado, sobre la precisión del método. Tabla 6. Prueba de significación entre las pendientes de la curva La precisión y veracidad de cada método de ensayo se de calibración acuosa y la curva de adición estándar establecen durante la validación del mismo pero en la práctica cotidiana el laboratorio deberá demostrar que es Pendiente (m) Pendiente (m) t-student t-student capaz de mantener de forma estable estos niveles de curva de curva de calculada crítica desempeño mediante procedimientos de control de calidad calibración adición de los resultados. acuosa estándar 0,243 0,259 0,163 0,194 Estudio de Interferencias Las pruebas de recuperación permiten determinar si existen o no interferencias por parte de la matriz, se usan Determinación de magnesio en muestras reales para medir errores sistemáticos debidos a sustancias El método antes validado se aplicó para la determinación distintas del analito. Para conocer la presencia de posibles de magnesio en muestras de glóbulos rojos provenientes de efectos de matriz se compararon estadísticamente los pacientes: estudiantes de la Facultad Facultad de Farmacia valores de las pendientes de la curva de calibración acuosa y Bioanálisis de la Universidad de Los Andes de Mérida, con la curva de adición estándar, mediante análisis Venezuela, con edades comprendidas entre 20 y 40 años estadístico utilizando la prueba t-Student. Los resultados de edad, aparentemente sanos, a quienes se les investigó obtenidos permitieron observar que no existen diferencias mediante cuestionario si habían padecido o padecían de significativas entre las pendientes, ya que la t-Student patologías tales como diabetes, enfermedades tiroideas, calculada es menor que la t-Student crítica, a un nivel de hepáticas, gástricas, artritis, osteoporosis, y alteraciones confianza del 95%, tal como se observa en la Tabla 6. Esto menstruales en las pacientes femeninas, el estilo de vida, la indica que no existen interferencias causadas por la matriz alimentación, y la ingestión de medicamentos o de en la determinación de magnesio eritrocitario por anticonceptivos. Estos pacientes, previa invitación, R. Suarez, E. Arévalo, L. Linares, F. Ustáriz, G. Hernández /Avances en Química 4 (2), 53-62 (2009) 61 acudieron voluntariamente al Laboratorio Análisis Referencias Instrumental de la Escuela de Bioanálisis de la Facultad de 1. Norma ISO/IEC 17025: 1999. “Requisitos Generales para la Farmacia y Bioanálisis de la Universidad de Los Andes de Competencia de los Laboratorios de Ensayo y de Mérida, Venezuela y dieron su consentimiento por escrito Calibración”. para participar en la investigación. Para estos análisis se seleccionaron al azar 20 pacientes entre los que 2. Weisinger J, Bellorin E. Magnesium and Phosphorus. Lancet, 352 (3125), 391-396 (1998). respondieron que no padecían ni habían padecido alguna de las patologías antes mencionadas. 3. López G. Magnesio En el organismo y métodos de análisis. Trabajo de Ascenso a Profesor Titular. Facultad de Los resultados obtenidos se expresan en miligramos de Farmacia y Bioanálisis. Universidad de Los Andes, Mérida magnesio por decilitro de eritrocitos (mg(dL). Estos (Venezuela). 1995. resultados arrojaron un valor promedio de magnesio correspondiente a 5,17± 0,02 mg/dL, el valor mínimo 4. Sabatier M, Arnaud M, Kastenmaster P, Rytz A, Barclay D. Meal effect on Magnesium Bioavailability from Mineral encontrado corresponde a 4,2 mg/dL y el valor máximo Water in Healthy Women. American Journal of Clinical encontrado en este grupo de pacientes fue de 6,65 mg/dL. Nutrition, 75(1), 65-71 (2002). Estos valores se encuentran dentro de los valores de referencia (4-6,44 mg/dL) establecidos para la 5. Institute of Medicine (US). Dietary Reference Intakes for determinación de magnesio en glóbulos rojos por la Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington DC: The National Academy Press; p: técnica de espectrofotometría de absorción molecular utilizando el método de la calmagita18 190-249 (1997). . 6. Reinhart R. Magnesium metabolism. Archives of Internal Conclusiones Medicine, 148 (11), 2415-2420 (1988) Se estableció que la metodología analítica estudiada para 7. Topf J, Murray P. Hypomagnesemia and Hypermagnesemia. la determinación de magnesio en glóbulos rojos utilizando Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders, 4(2), 195-200 (2003). la espectrofotometría de absorción atómica es lineal en el intervalo de concentración estudiada, basado en el valor 8. Ryzen E, Elkayam U, Rude R. Low blood mononuclear cell obtenido para el coeficiente de correlación, y corroborado magnesium in intensive cardiac care unit patients. con la inspección visual de la gráfica de la curva de American Heart Journal, 111, 475-480 (1986). calibración. Adicionalmente, se comprobó la linealidad 9. Elin R, Hosseini J, Fitzpatrick L, Bliziotes M, Marx S. mediante la determinación del coeficiente de variación de Magnesium status of patients with parathyroid disease. los factores de respuesta, se corroboró que el valor de la Magnesium Trace Element, 9(3), 119-123 (1990). pendiente es significativamente distinto de cero y que el 10. Sedighi M, Pourpak Z, Bavarian B, Alizadeh R, Zare A, intercepto no está estadísticamente alejado de cero. Moin M. Low Magnesium Concentrations in Erythrocytes Para el estudio de la exactitud mediante prueba de of Children with Acute Asthma. Iranian Journal of Allergy, Asthma and Immunology, 5(4), 183-186 (2006). adición/recuperación, se demostró que el porcentaje de recuperación promedio está dentro de los criterios de 11. Simsek E, Karabay M, Kocabay K. Assessment of aceptación y también se verificó la linealidad de la curva magnesium status in newly diagnosed diabetic children: de recuperación y que es independiente de la measurement of erythrocyte magnesium level and concentración, por lo tanto la metodología es exacta. magnesium tolerance testing. The Turkish Journal of Pediatrics, 47(2), 132-137 (2005). La metodología estudiada aprobó los ensayos de 12. Kosch M, Hausberg M, Westermann G, Köneke J, Matzkies repetibilidad al determinarse un coeficiente de variación F, Heinz K, Kisters K. Alteraciones del contenido de calcio (C.V.) menor al 1%, e igualmente los de precisión y magnesio de las membranas de los hematíes en pacientes intermedia, al ser el C. V. menor al 2%, con lo que se con hipertensión primaria. American Journal of concluye que la metodología es precisa. Hypertension (Edición Español), 3, 296-301 (2001). El estudio demostró que la metodología analizada cumple 13. Kisters K, Barenbrock M, Louwen F, Hausberg M, Heinz K, con los parámetros mínimos de linealidad, exactitud y Kosch M. Membrane, Intracellular, and Plasma Magnesium precisión, por lo tanto el método se encuentra validado. and Calcium Concentrations in Preeclampsia. American Journal of Hypertension, 13(7), 765-769 (2000). Agradecimiento 14. Zervas E, Papatheodorou G, Psathakis K, Panagou P, Al Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico y Tecnológico Georgatou N, Loukides S. Reduced Intracellular Mg (CDCHT) de la Universidad de Los Andes, Mérida, Venezuela, Concentrations in Patients With Acute Asthma. Chest, 123, por financiar esta investigación (FA-429-08-07-F). 113-118 (2003). 62 R. Suarez, E. Arévalo, L. Linares, F. Ustáriz, G. Hernández /Avances en Química 4 (2), 53-62 (2009) 15. Prasad A, Oberleas D, Halsted J. Determination of zinc in biological fluids by atomic absorption spectrophtometry in normal and cirrhotic subjects. Journal laboratory & Clinical Medicine, 66(3), 508-14 (1965). 16. Spectroscopy Atomic Manual Perkin Elmer 3110. 1982. 17. Australian Pesticides, and Veterinary Medicines Authority (APVMA). Guidelines for The Validation of Analytical Methods for Active Constituent, Agricultural and Veterinary Chemical Products. 2004 18. Biolabo Reagents. Magnesium Calmagite. Reagent for Cuantitative Determination of Magnesium in Human serum, Plasma, Red Cells (RBC) and Urines. France. 1995. 19. Taylor J. Validation of Analytical Methods. Analytical Chemistry, 55, 600A-608A (1933). 20. Long Gary L, Winefordner J. D. Report Limit of Detection. A Closer Look at the IUPAC Definition. Analytical Chemistry, 55(7), 712A-724A (1983). 21. International Vocabulary of Basic and General Terms in Metrology, VIM, ISO, Ginebra. 1993 Organización Internacional para la Estandarización Estadística. Vocabulario y Símbolos. Parte 1: Probabilidad y Términos estadísticos en General. Ginebra: ISO, 1993. 22. Vickers T. Atomic Fluorescence and Atomic Absorption Spectroscopy. Physical Methods. In: Modern Chemical Analysis. Edited by Theodore Kuwana. Academic Press. New York. 1978; 1: 235-9 23. International Conference on Harmonisation. Note for guidance on Validation of analytical methods: methodology.1995. In: Gamara FL, Correr CJ, Sato M, Pontarolo R. Desarrollo y validación de un método espectrofotométrico para cuantificación de ácido kojico. Ars Pharmaceutica, 45(2), 145-153 (2004).